ksu_memo
29.01.2010, 16:19
BİTKİ VİRÜSLERİNİN SEROLOJİSİ
“Antijen” olarak adlandırılan virüs proteini veya yabancı herjangi bir madde memeli hayvana (tavşan, at, fare..vs) veya kuşlara tavuk, hindi) enjekte edildiklerinde hayvanın kan sıvısında veya serumunda sirküle eden spesifik protein (antibadi) üretilir. Antibadiler enjekte edilen antijenlerin yüzeyindeki “antijenik determinant”lara bağlanır.
Her antijen (virüs) yüzeyinde 6-10 a.a. Ten meydana gelmiş antijenik determinant bölgeye sahiptir. Herbiri farklı bir antibadinin üretimini sağlar. Hayvanın “antiserum”u (serum içeren antibadiler) farklı antibadiler içeren bir karışımdır.
Antibadi karışımları, virüs yüzeyindeki her farklı yüzey için üretilmiş olan antibadiyi içerir ve “poliklonal antiserum” adını alır.
Virüsün tek bir antijenik determinant bölgesine spesifik proteinler elde etmek mümkündür ve “monoklonal antiserum” adını alır.
Monoklonal antiserum üretilmesi için hayvanın bağışıklık sitemindeki hücreler (dalak)den yararlanılır. Dala hücrelerinden tek tip antiserumun çok sayıda kopyasını elde etmek mümkündür. Ancak bu hücreler bölünme yeteneğinde olmadığından kullanımları sınırlıdır.
Ancak antiserum üretilen hücrelerle hayvan kanser hücreleri füzyon edilip kültüre alınabilen ve sınırsız büyüyen hibrid hücreler elde edilir. Böylece sürekli monoklonal antiserum üretimi sağlanır. Antiserum üreten hibrid hücreler “hibridoma” denir.
Hibridoma kültürlerinden monoklonal antiserum üretimi yüksek miktarlarda ve saflıkta yapılır. Monoklonal antiserumlar aynı virüsün belli ırklarını teşhis etmeye spesifiktir. Tek antijenik determinant bölgelere sahip olduğundan farklı ırkları teşhiste güçlük yaşanır ve bu durumda monoklonal antiserum kokteyli kullanılır.
VİRÜS HASTALIKLARI TEŞHİS YÖNTEMLERİ
1. Biyolojik indeksleme; odunsu bitkilerin patojen teşhisi yapılamamış ve virüs kaynaklı olduğu şüphesi taşıyan virüs-benzeri hastalıkların teşhisi indeksleme ile yapılmaktadır.
indeksleme, “indikatör” olarak adlandırılan bazı bitki türlerine veya varyetelerine mekanik inokülasyon ve aşılama ile yapılmaktadır. İndikatörler spesifik virüslere hassastır ve bu virüslerle inoküle edildiklerinde indikatörlerde virüsün tanımlanmasına yardımcı olacak spesifik simptomlar verirler.
Mekanik inokülasyon
aşı indeksleme
2. Serolojik test: Virüs ve spesifik antiserumu birçok şekilde bir araya getirilir; bu alanda en erken ve yayın olan şekli “precipitin test” (çökelme) testi şeklidir.
ELISA (enzyme linked-immunosorbent assay); antiserum ve antijen polistrene mikrotiter plakalarda bir araya getirilir. Virüse spesifik antiserumlar enzimle işaretlenir ve enzimi harekete geçirecek olan substrat madde ile renk dönüşümü sağlanır.renk dönüşümün şiddeti veya dalga boylarıyla yapılan okumad çıkan değerlerin büyüklüğü örnekteki virüs miktarını vermektedir.
Direkt ELISA
İndirekt ELISA
Precipitin test; antiserum ve antijenler solüsyon içerisinde karıştırılır.
Jel diffüzyon testi; antiserum ve antijenler agar jel üzerinde birbirlerine doğru diffüze olur (hareket eder) ve uygun konsantrasyonlarda bir bölgede buluşurlar.
Agglutination reaksiyon; antijen büyük bir partiküle, bir hücreye, plastide veya latex ortma absorbe edilir ve antiserum eklenmesiyle çöktürülür.
İmmunosorbent elektron mikroskobu; infekteli hücredeki virüs partiküllerini teşhis etmek ve düşük konsantrasyondaki virüsü bulmak için elektron mikroskobu ile gözlem yapılır. Düşük konsantrasyonlu virüsle hazırlanmış olan karbon kaplı gridler antiserumla tekrar kaplanır, yakalnmış olan virüs partikülleri elektron mikroskobuyla kolaylıkla gözlenir.
İmmunofluorescent staining; tam hücreler, bitki yaprağı veya hücre kısımları öncelikle fikse edilir, daha sonra aseton veya diğer organik maddelerle (fluorescein isothiocyanate (FITC)), UV ışınlarıyla gözlenir. Virüs ile infekteli hücrelerde virüs ve antiserum buluşur ve floresan madde yansıması gözlenir.
Western blot; antiseruma bağlanmış virüsün herhangi bir protein yapısını teşhis ederek test yapılır.
3. Molecular test; araştırılan virüsün nükleik asit yasını teşhisle yapılır.
PCR (polymerase chain reaction); virüsün hedef nükleik asit bölgesine spesifik hazırlanmış kısa dizinli DNA dizinleriyle (primer) n.a. ‘in sonsuz sayıda çoğaltılmasıyla uygulanan bir yöntemdir. Yöntem DNA ile uygulandığından virüs RNA’sının tersine transkripsiyon yöntemiyle tamamlayıcı DNA’sının sentezlenmesiyle kombine edilir.
Moleküler hibridizasyon; tek veya çift sarmallı RNA’ya spesifik sentezlenen tamamlayıcı DNA için daha sonra oluşturulan tek veya çift sarmallı DNA ile hibrde edilmesiyle uygulanır.
“Antijen” olarak adlandırılan virüs proteini veya yabancı herjangi bir madde memeli hayvana (tavşan, at, fare..vs) veya kuşlara tavuk, hindi) enjekte edildiklerinde hayvanın kan sıvısında veya serumunda sirküle eden spesifik protein (antibadi) üretilir. Antibadiler enjekte edilen antijenlerin yüzeyindeki “antijenik determinant”lara bağlanır.
Her antijen (virüs) yüzeyinde 6-10 a.a. Ten meydana gelmiş antijenik determinant bölgeye sahiptir. Herbiri farklı bir antibadinin üretimini sağlar. Hayvanın “antiserum”u (serum içeren antibadiler) farklı antibadiler içeren bir karışımdır.
Antibadi karışımları, virüs yüzeyindeki her farklı yüzey için üretilmiş olan antibadiyi içerir ve “poliklonal antiserum” adını alır.
Virüsün tek bir antijenik determinant bölgesine spesifik proteinler elde etmek mümkündür ve “monoklonal antiserum” adını alır.
Monoklonal antiserum üretilmesi için hayvanın bağışıklık sitemindeki hücreler (dalak)den yararlanılır. Dala hücrelerinden tek tip antiserumun çok sayıda kopyasını elde etmek mümkündür. Ancak bu hücreler bölünme yeteneğinde olmadığından kullanımları sınırlıdır.
Ancak antiserum üretilen hücrelerle hayvan kanser hücreleri füzyon edilip kültüre alınabilen ve sınırsız büyüyen hibrid hücreler elde edilir. Böylece sürekli monoklonal antiserum üretimi sağlanır. Antiserum üreten hibrid hücreler “hibridoma” denir.
Hibridoma kültürlerinden monoklonal antiserum üretimi yüksek miktarlarda ve saflıkta yapılır. Monoklonal antiserumlar aynı virüsün belli ırklarını teşhis etmeye spesifiktir. Tek antijenik determinant bölgelere sahip olduğundan farklı ırkları teşhiste güçlük yaşanır ve bu durumda monoklonal antiserum kokteyli kullanılır.
VİRÜS HASTALIKLARI TEŞHİS YÖNTEMLERİ
1. Biyolojik indeksleme; odunsu bitkilerin patojen teşhisi yapılamamış ve virüs kaynaklı olduğu şüphesi taşıyan virüs-benzeri hastalıkların teşhisi indeksleme ile yapılmaktadır.
indeksleme, “indikatör” olarak adlandırılan bazı bitki türlerine veya varyetelerine mekanik inokülasyon ve aşılama ile yapılmaktadır. İndikatörler spesifik virüslere hassastır ve bu virüslerle inoküle edildiklerinde indikatörlerde virüsün tanımlanmasına yardımcı olacak spesifik simptomlar verirler.
Mekanik inokülasyon
aşı indeksleme
2. Serolojik test: Virüs ve spesifik antiserumu birçok şekilde bir araya getirilir; bu alanda en erken ve yayın olan şekli “precipitin test” (çökelme) testi şeklidir.
ELISA (enzyme linked-immunosorbent assay); antiserum ve antijen polistrene mikrotiter plakalarda bir araya getirilir. Virüse spesifik antiserumlar enzimle işaretlenir ve enzimi harekete geçirecek olan substrat madde ile renk dönüşümü sağlanır.renk dönüşümün şiddeti veya dalga boylarıyla yapılan okumad çıkan değerlerin büyüklüğü örnekteki virüs miktarını vermektedir.
Direkt ELISA
İndirekt ELISA
Precipitin test; antiserum ve antijenler solüsyon içerisinde karıştırılır.
Jel diffüzyon testi; antiserum ve antijenler agar jel üzerinde birbirlerine doğru diffüze olur (hareket eder) ve uygun konsantrasyonlarda bir bölgede buluşurlar.
Agglutination reaksiyon; antijen büyük bir partiküle, bir hücreye, plastide veya latex ortma absorbe edilir ve antiserum eklenmesiyle çöktürülür.
İmmunosorbent elektron mikroskobu; infekteli hücredeki virüs partiküllerini teşhis etmek ve düşük konsantrasyondaki virüsü bulmak için elektron mikroskobu ile gözlem yapılır. Düşük konsantrasyonlu virüsle hazırlanmış olan karbon kaplı gridler antiserumla tekrar kaplanır, yakalnmış olan virüs partikülleri elektron mikroskobuyla kolaylıkla gözlenir.
İmmunofluorescent staining; tam hücreler, bitki yaprağı veya hücre kısımları öncelikle fikse edilir, daha sonra aseton veya diğer organik maddelerle (fluorescein isothiocyanate (FITC)), UV ışınlarıyla gözlenir. Virüs ile infekteli hücrelerde virüs ve antiserum buluşur ve floresan madde yansıması gözlenir.
Western blot; antiseruma bağlanmış virüsün herhangi bir protein yapısını teşhis ederek test yapılır.
3. Molecular test; araştırılan virüsün nükleik asit yasını teşhisle yapılır.
PCR (polymerase chain reaction); virüsün hedef nükleik asit bölgesine spesifik hazırlanmış kısa dizinli DNA dizinleriyle (primer) n.a. ‘in sonsuz sayıda çoğaltılmasıyla uygulanan bir yöntemdir. Yöntem DNA ile uygulandığından virüs RNA’sının tersine transkripsiyon yöntemiyle tamamlayıcı DNA’sının sentezlenmesiyle kombine edilir.
Moleküler hibridizasyon; tek veya çift sarmallı RNA’ya spesifik sentezlenen tamamlayıcı DNA için daha sonra oluşturulan tek veya çift sarmallı DNA ile hibrde edilmesiyle uygulanır.